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ENCEFALOPATIA CDKL5: NUOVO APPROCCIO TERAPEUTICO PER MIGLIORARE LO SVILUPPO CEREBRALE IN UN MODELLO MURINO KNOCKOUT PER CDKL5

Introduzione

ENCEFALOPATIA CDKL5:  TERAPIA GENICA
L’encefalopatia CDKL5 recentemente descritta, associata alla mutazione del gene CDKL5, è una gravissima patologia neurologica progressiva caratterizzata da perdita del linguaggio, riduzione delle abilità motorie, crisi respiratorie, stereotipie delle mani, severo ritardo mentale, tratti autistici ed epilessia. L’encefalopatia CDKL5 è una rara patologia legata al cromosoma X (incidenza di circa 1 su 10000 neonati) caratterizzata da un fenotipo sovrapponibile in larga parte alla sindrome di Rett (1-5). Generalmente la maggior parte dei casi di sindrome di Rett sono causati da mutazioni nel gene MeCP2 (6, 7). Tuttavia, una frazione significativa (intorno al 30%) dei bambini affetti da sindrome di Rett non presenta mutazioni in questo gene. Recenti scoperte hanno evidenziato la possibilità che mutazioni nel gene CDKL5 possano essere responsabili di una nuova patologia in molti aspetti clinici sovrapponibile alla sindrome di Rett, ma che presenta anche caratteristiche specifiche (1, 2). La differenza che contraddistingue i pazienti CDKL5 è la comparsa di crisi epilettiche durante le prime settimane di vita ed un ritardo nello sviluppo cognitivo/motorio non preceduto da uno sviluppo normale (8, 9). I pazienti CDKL5 sono anche caratterizzati da dismorfismi tra cui: grandi occhi infossati, strabismo, fronte alta, labbra carnose, bocca larga, denti distanziati e un palato alto (9). A tutt’oggi la comprensione del profilo patologico associato a CDKL5 è ancora limitata e non si sa come mutazioni o deregolazione dell’espressione di CDKL5 determino il fenotipo della patologia.
Studi nei roditori hanno mostrato che CDKL5 è espressa sia nel cervello adulto sia in via di sviluppo (10, 11), il che suggerisce che CDKL5 possa essere importante per il differenziamento neuronale. Infatti, e’ stato dimostrato che CDKL5, oltre a presentare un profilo d’espressione correlato con la maturazione neuronale e la sinaptogenesi (10), ha un ruolo nella formazione dei dendriti nei neuroni corticali (12). Il ruolo di CDKL5 nello sviluppo del sistema nervoso è stato parzialmente chiarito da studi effettuati sul primo modello di topo knockout (KO) per CDKL5, creato presso l’EMBL di Monterotondo- Italia, in collaborazione con il DIBINEM, Università di Bologna (Dott.ssa Elisabetta Ciani). Abbiamo evidenziato che il modello murino di encefalopatia CDKL5 presenta una generalizzata compromissione della sopravvivenza dei precursori neuronali e un’alterata maturazione dendritica, accompagnata ad un deficit comportamentale di memoria ed apprendimento (Fuchs et al. in preparazione). Questo risultato è molto importante, in quanto il modello murino potrebbe rappresentare un valido strumento per ideare possibili approcci terapeutici per la patologia associata a CDKL5.

TERAPIA PROTEICA: UNO STRUMENTO PROMETTENTE PER LE PATOLOGIE GENETICHE CEREBRALI
Ci sono molte aspettative nella terapia genica – ovvero la sostituzione di un gene mutato responsabile di una malattia con una copia corretta dello stesso gene – nel trattamento dei disordini neurologici su base genetica sono alte. Purtroppo, però, la terapia genica a livello cerebrale non ha fatto molti progressi, in quanto il problema del trasferimento del gene non è stato risolto. Recentemente è stato sviluppato un nuovo approccio terapeutico, alternativo alla terapia genica, denominato “trasduzione proteica” o “terapia proteica”, mediante il quale diventa possibile il trasporto vascolare di una proteina esogena nell’encefalo, in seguito ad una semplice iniezione sistemica. Studi recenti hanno dimostrato che alcune particolari proteine e peptidi hanno la singolare capacità di attraversare le membrane cellulari. Tale proprietà è generalmente dovuta alla presenza in queste proteine di un Dominio di Trasduzione Proteica (PTD). I PDT sono piccoli peptidi capaci di veicolare molecole molto grandi all’interno delle cellule, secondo un meccanismo indipendente dalla classica endocitosi. Pertanto i PTD sono potenziali e preziosi strumenti terapeuici, poiché possono essere utilizzati per veicolare molecole in cellule viventi in condizioni fisiologiche. Le prime proteine descritte con capacità di trasduzione sono di origine virale. La proteina del virus HIV-1, Transattivatore della Trascrizione (TAT), è la proteina più studiata contenente un PTD (13). I primi esperimenti condotti utilizzando il dominio PTD della TAT hanno dimostrato l’effecacia di tale peptide nel trasdurre grandi proteine di fusione (fino a 120 kDa) all’interno di cellule murine (14-16). Schwarze e colleghi. (15) hanno dimostrato che una proteina ricombinante TAT--galattosidasi iniettata intraperitonealmente nel topo si distribuisce in tutti i tessuti, compreso l’encefalo, mantenendo la sua attività biologica. E’ importante notare che ad oggi non sono stati riscontrati problemi nè di tossicità nè di immunogenicità da parte del dominio PTD della TAT.
Recentemente il Prof. Franco Laccone (attualmente genetista presso l’Istituto di Genetica Medica dell’Università di Vienna) ha sviluppato una sequenza sintetica di MeCP2 per la terapia proteica sostitutiva (Patent WO/2007/115578; University of Göttingen, Germany). L’innovazione consiste nell’ottimizzazione dei codoni di tale sequenza nucleotidica al fine di ottenere l’espressione in sistemi eterologhi (proteina umana in Escherichia colϊ) della proteina MeCP2 fusa con il dominio PTD della TAT. Il Prof. Laccone ha dimostrato che la proteina di fusione TAT-MeCP2 purificata conserva l’attività biologica ed è trasportata efficacemente nel sistema nervoso centrale. Ha dimostrato, inoltre, che iniezioni giornaliere della proteina purificata TAT-MeCP2 aumentano l’apprendimento motorio e la durata della vita di un modello murino di sindrome di Rett (Mecp2 y/) (http://www.google.com/patents/US20090233856).
Questi risultati dimostrano per la prima volta il possibile utilizzo a scopo terapeutico di una proteina di fusione con il peptide TAT nel sistema nervoso centrale, al fine di migliorare il decorso di una patologia genetica.

Obiettivo del progetto di ricerca

Attualmente non esistono terapie per migliorare il fenotipo neurologico dei pazienti con encefalopatia CDKL5. Dal momento che, ad oggi, la terapia genica non rappresenta una possibilità concreta per il trattamento delle malattie neurologiche, l’obiettivo del presente progetto è di sviluppare una terapia proteica mirata a compensare la mancanza di una proteina CDKL5 funzionale, utilizzando un modello murino della patologia. Recentemente, abbiamo creato e purificato una proteina di fusione TAT-CDKL5, che mantiene l’attività chinasica di CDKL5 ed è capace di penetrare all’interno di cellule di derivazione neuronale. Questi risultati prospettano la possibilità di una terapia proteica anche per l’encefalopatia CDKL5. L’obiettivo del progetto è stabilire se sia possibile migliorare lo sviluppo cerebrale in un modello murino KO per CDKL5, mediante il ripristino dei livelli di CDKL5 nel cervello. È importante sottolineare che le terapie proteiche hanno la possibilità di essere trasferite velocemente dal modello animale all’uomo.

Piano di Attività

Validazione dell’attività’ anti-proliferativa e pro-differenziativa della TAT-CDKL5 in un modello cellulare neuronale
Recentemente abbiamo scoperto che CDKL5 induce il differenziamento ed inibisce la proliferazione in un modello neuronale in vitro, la linea cellulare di neuroblastoma SH-SY5Y (17). Per validare l’attività biologica della proteina di fusione TAT-CDKL5, verificheremo in cellule di neuroblastoma SH-SY5Y se essa mantenga attività anti-proliferativa e pro-differenziativa. Nelle cellule trasdotte con la proteina di fusione TAT-CDKL5 analizzeremo i tassi di proliferazione mediante saggio d’incorporazione della bromodeossiuridina (BrdU). In colture parallele, esamineremo la crescita neuritica come indice di differenziamento neuronale. La crescita dei neuriti verrà misurata utilizzando un sistema di analisi di immagine.

Efficienza di trasferimento della proteina TAT-CDKL5 nel cervello e valutazione degli effetti collaterali
Affronteremo il problema del trasferimento della proteina in vivo nel cervello e degli effetti collaterali derivanti da dosi crescenti della TAT-CDKL5. Una prima caratterizzazione del modello ha mostrato che il topo CDKL5 KO presenta una diminuzione di sopravvivenza e maturazione neuronale, accompagnata da una riduzione delle capacità cognitive ippocampo dipendenti (Fuchs et al in preparazione). Esamineremo gli effetti del trattamento in topi neonati, poiché, trattamenti effettuati durante le prime e più critiche fasi dello sviluppo dovrebbero rappresentare la scelta ottimale per migliorare i deficit dello sviluppo cerebrale di questi topi.
Studi con singola dose Gruppi distinti di topi neonati (al secondo giorno post-natale) wild type e KO riceveranno una singola iniezione intraperitoneale (i.p.) di TAT-CDKL5 o di TAT-GFP (come controllo) a dosi diverse (da 5 a 300 g per grammo di peso corporeo). Per stabilire l’andamento temporale di degradazione della TAT-CDKL5 a livello cerebrale, gli animali verranno sacrificati a 2, 6, 12 e 24 ore dopo l’iniezione. Il cervello verrà prelevato e omogeneizzato per estrarre le proteine. Analizzeremo 50 g di lisato proteico tramite Western blotting con l’anticorpo anti-TAT per valutare la quantità di proteina TAT-CDKL5 nel cervello. Per paragonare l’efficienza di trasferimento della proteina nel cervello rispetto ai tessuti periferici, analizzeremo tramite Western blotting anche estratti proteici totali ottenuti da fegato, cuore e rene. In esperimenti indipendenti di immunocitichimica su fettine di cervello esamineremo la distribuzione della TAT-CDKL5 in varie regioni cerebrali e verificheremo la presenza della proteina all’interno delle cellule cerebrali.
Protocollo con dosi ripetute Topi neonati wild type (al secondo giorno post-natale) verranno iniettati i.p. per 2 settimane con la TAT-CDKL5 o la TAT-GFP. La dose della TAT-CDKL5 sarà determinata sulla base dei risultati ottenuti con le iniezioni a singola dose e verrà utilizzata la dose ottimale (quella con decadimento più lento e senza effetti tossici). Lo stato fisico e il peso degli animali verranno verificati giornalmente. Gli animali verranno sacrificati ventiquattro ore dopo la somministrazione dell’ultima dose. La concentrazione proteica di TAT-CDKL5 nel cervello e nei tessuti periferici verrà valutata come descritto sopra. Per valutare se la somministrazione di TAT-CDKL5 ha effetti tossicologiche nei topi, faremo un profilo di espressione di geni chiave, appartenenti a differenti vie di segnalazione note per essere attivate in risposta a farmaci tossici. Utilizzeremo il kit per real-time PCR “Mouse Molecular Toxicology PathwayFinder PCR Array” per analizzare l’espressione dei 370 geni del kit in omogenati di fegato e di cervello degli animali trattati e di controllo.
Questi esperimenti ci permetteranno di valutare la penetrazione a livello cerebrale della proteina TAT-CDKL5 iniettata, il suo decadimento nel cervello se essa eserciti effetti tossici dose dipendenti.

Effetti del trattamento con la proteina TAT-CDKL5 sulla maturazione neuronale nei topi CDKL5-KO
Determineremo l’effetto della proteina di fusione TAT-CDKL5 sulla maturazione dei neuroni nel cervello di topi CDKL5-KO. Topi CDKL5-KO neonati riceveranno iniezioni giornaliere della proteina (dose ottimale: vedi sopra) e verranno sacrificati dopo 1, 2, 4 settimane. Sezioni cerebrali di topi trattati e di controllo verranno marcate con un anticorpo fluorescente per la doublecortine (DCX), una proteina citoplasmatica espressa dai granuli ippocampali durante il periodo che va dallo stadio proliferativo dei progenitori ad una fase post mitotica in cui le cellule sono caratterizzate da lunghi dendriti. In tali sezioni sarà possibile esaminare la maturazione dei dendriti dei granuli a seguito del trattamento. Utilizzeremo anche il metodo di Golgi per poter eseguire una ricostruzione morfometrica dell’albero dendritico di granuli maturi e la tempistica di crescita delle spine sia dei granuli sia dei neuroni piramidali ippocampali. Valuteremo la morfometria dell’albero dendritico e la densità delle spine mediante un software specifico.

Risultati attesi

Questo progetto ci permetterà di stabilire se sia possibile migliorare i deficit dello sviluppo cerebrale in un modello di topo che mima l’encefalopatia CDKL5, mediante l’utilizzo di un approccio innovativo. Poiché l’approccio qui proposto è potenzialmente utilizzabile nell’uomo, il nostro studio potrebbe aprire la strada a futuri trials clinici.

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